Sembrar el hongo que se ha aislado directamente del insecto presente en la caja con medio saboraud, en un tubo inclinado con -medio de cultivo de fitolevadura e incubarlo a 20 oC durante 5 días.
Preparar una solución de Tween 80 al 0.1% como sigue:
De la formulación comercial, hacer una dilución al 10%:
Tomar 10 ml de Tween 80 y agregar 90 ml de agua destilada. Esta solución se puede mantener en stock en refrigeración (10oC).
Para la preparación del Tween al 0.1%, tomar 1 ml de la solución al 10% y agregar 99 ml de agua destilada. Esta solución se esteriliza en el autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.
Preparar una suspensión de esporas, a partir del tubo con el hongo en desarrollo.
En un eppendorf con 1 ml de la solución de Tween al 0.1% colocar una pequeña porción del hongo y agitar ligeramente para que se separen todas las esporas.
Agitar en un vortex por espacio de 15 segundos y colocar en baño maría de ultrasonido durante 3 minutos.
Cargar un hematocímetro o cámara de Neubauer y contar el número de esporas bajo el microscopio de visión plana.
Para realizar una segunda dilución, tomar 100 μl de la suspensión anterior y agregar 900 μl de agua destilada, agitar en el vortex.
Hacer las diluciones que sean necesarias para tener una suspensión a una concentración de 50 a 100 esporas por mililitro.
Sembrar 100 μl de la concentración deseada en una placa con medio PDA y distribuirla con una espátula de Drigalski, dentro de la cámara de flujo laminar.
Incubar a 20 oC por espacio de una semana.
Cortar con una hoja de bisturí estéril una colonia en formación y transferirla a otra placa con PDA.
La idea es que la colonia a cortarse provenga de una sola conidia
Aislamiento de punta de hifa
Es otro método de producir un cultivo puro proveniente de una sola conidia. Para ello se sigue la siguiente secuencia:
Preparar una dilución de conidias de 2500/ml con Tween 80 al 1% estéril.
Poner en un vaso de precipitación una cantidad conveniente de agar agua caliente (40oC). Este método es muy tedioso de ejecutar y tiene el inconveniente de que se contamina con facilidad Sumergir el extremo de una lámina portaobjetos en el vaso y sacarlo.
Limpiar la superficie inferior de la lámina y colocarla en una placa
Petri. La placa debe tener un papel de filtro estéril en el fondo, humedecido con agua destilada estéril. Es recomendable poner la lámina sobre una varilla de vidrio en forma de V también estéril dentro de la placa.
Sembrar el hongo con una ansa en la porción de la lámina que tiene la película del medio y estirarla cuidadosamente.
Incubar por dos - tres días.
Observar en cámara de flujo laminar al microscopio las colonias que se han formado.
Escoger la colonia que esté más aislada.
Buscar al microscopio la punta de una hifa solitaria y cortarla.
Poner la punta cortada en placa Petri conteniendo PDA o Fitoagar.
http://www.cipotato.org/library/pdfdocs/AN65216.pdf
Gracias por compartir este articulo !!
ResponderEliminarRealmente me siento frustrado por estos insectos. Thay daña las plantas de mi jardín y no hago nada por eso. Pero después de leer este artículo, sé cómo deshacerme de estos cochinillas y trips
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