martes, 29 de noviembre de 2011
lunes, 28 de noviembre de 2011
Glosario
Entomopatógenos.- Microorganismos que producen enfermedades a los insectos, siendo el agente causal muy diverso. Penetran en la especie plaga a través del tubo digestivo o del tegumento dando lugar a la expresión de la enfermedad que provoca la muerte del hospedante. Los entomopatógenos son los únicos que no buscan de forma activa a sus presas, a excepción de los nemátodos
Hifa.- Una estructura filamentosa y tubular, que constituye la célula individual fúngica. Las hifas se desarrollan en red formando su conjunto el micelio.
Conidias.- Espora asexual, formada generalmente en el extremo de una hifa. Aparecen en Ascomycotina, Deuteromycotina y algunos Basidiomycotina
Blastósporas .- Espora formada por gemación.
Desarrollo micelial.- Proceso de la parte vegetativa de los hongos, para la formación de los esporos y frucitificaciones.
Hemocele.- Senos o espacios del cuerpo no revestidos de peritoneo y llenos de sangre característicos de muchos invertebrados.
Eppendorf.- tubos delgados de polipropileno que transmiten el calor a la prueba de una forma eficiente y homogénea, gracias a la pared lisa y de grosor uniforme.
Conidiógenas.- Células especializadas de donde nacen los conidios.
Conidióforos.- Hifa que aporta células conidiógenas.
sábado, 26 de noviembre de 2011
La despedida....
Antes de irnos queremos dejarte este link de vídeo.... que no abarca todo lo que mencionamos en este blog y esperamos te halla servido.... pero si nos muestra datos interesantes así como varios ejemplos de insectos con este MO. Hasta luego! :D
http://www.youtube.com/watch?v=bqmckMKdLpU&feature=BFp&list=FLR1e60taceqLgFKo2sLKL1A
¿Ahora cómo identificar si es realmente el hongo?
Esto se hace por medio de un análisis y descripción de las características del hongo obtenido. Para esta última se realiza una observación microscópica de sus estructuras, es necesario realizar una tinción o coloración, siendo el procedimiento el siguiente:
1. Sembrar el hongo en una placa con medio de cultivo PDA.
2. Esperar el crecimiento por espacio de 15 días.
3. En una lámina portaobjetos, colocar una gota de azul de lactofenol u otra solución.
Azul de lactofenol (azul de algodón)
Ácido láctico 25 ml
Glicerina 50 ml
Agua destilada 25 ml
Azul de algodón 0.05 g
4. Con una aguja entomológica No. 000 ó con un alfiler minutum, tomar una pequeña muestra del tejido hifal y dispersarla en un portaobjetos sobre una gota del colorante y colocarle un cubreobjeto.
5. También se puede tocar levemente la superficie de una colonia en desarrollo con una cinta adhesiva transparente y pegarla sobre una lámina portaobjetos.
6. Observar al microscopio plano con aceite de inmersión, cuando las estructuras son muy pequeñas.
7. Medir la longitud y el diámetro de cualquier estructura de interés de acuerdo a la especie que se está observando.
Este método permite ver las estructuras sin que pierda su disposición natural y sin perturbar mucho su morfología.
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE
Beauveria bassiana
Colonia: la colonia en PDA a los 14 días es algodonosa a polvorienta, blanca.
A medida que va pasando el tiempo se vuelve amarillenta, cremosa. El revés es de color rojizo al centro y amarillento alrededor.
Conidióforos: de 1-2 de diámetro donde nacen células conidiógenas en grupos grandes.
Células conidiógenas (c.cs.): están agrupadas formando grupos compactos grandes y a veces solitarias, en forma de botellitas de 3 a 6 x 3 a 5μ. En ciertos casos, las c.cs. se ramifican formando c.cs secundarias. Al final de las c.cs se forma un raquis que sostiene las conidias.
Raquis: hasta de 20μ de longitud y 1μ de diámetro, denticulado, que sostiene una conidia en cada dentícula.
Conidias: hialinas, globosas a subglobosas, de 2 a 3 x 2 a 2.3μ que se insertan sucesivamente en el raquis en forma opuesta
Por otra parte las formulaciones en aceite aumentan la adhesión de la espora en la cutícula del insecto atraves de interacciones hidrofobicas entre la espora y la superficie de la cutícula, mejoran la infección en bajas humedades, no se evaporan, protegen las esporas del hongo sobre una rápida desecación y luz UV.
Un poco de técnica
Ahora queremos compartir contigo un poco de la técnica a seguir al aislar a este hongo....
Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad de crecimiento, etc. sin embargo, son más fáciles de contaminarse. Los tubos, a pesar de tener una superficie mucho más reducida, ofrecen seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo más o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir.
Aislamiento de Beauveria bassiana
Sembrar el hongo que se ha aislado directamente del insecto presente en la caja con medio saboraud, en un tubo inclinado con -medio de cultivo de fitolevadura e incubarlo a 20 oC durante 5 días.
Preparar una solución de Tween 80 al 0.1% como sigue:
De la formulación comercial, hacer una dilución al 10%:
Tomar 10 ml de Tween 80 y agregar 90 ml de agua destilada. Esta solución se puede mantener en stock en refrigeración (10oC).
Para la preparación del Tween al 0.1%, tomar 1 ml de la solución al 10% y agregar 99 ml de agua destilada. Esta solución se esteriliza en el autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.
Preparar una suspensión de esporas, a partir del tubo con el hongo en desarrollo.
En un eppendorf con 1 ml de la solución de Tween al 0.1% colocar una pequeña porción del hongo y agitar ligeramente para que se separen todas las esporas.
Agitar en un vortex por espacio de 15 segundos y colocar en baño maría de ultrasonido durante 3 minutos.
Cargar un hematocímetro o cámara de Neubauer y contar el número de esporas bajo el microscopio de visión plana.
Para realizar una segunda dilución, tomar 100 μl de la suspensión anterior y agregar 900 μl de agua destilada, agitar en el vortex.
Hacer las diluciones que sean necesarias para tener una suspensión a una concentración de 50 a 100 esporas por mililitro.
Sembrar 100 μl de la concentración deseada en una placa con medio PDA y distribuirla con una espátula de Drigalski, dentro de la cámara de flujo laminar.
Incubar a 20 oC por espacio de una semana.
Cortar con una hoja de bisturí estéril una colonia en formación y transferirla a otra placa con PDA.
La idea es que la colonia a cortarse provenga de una sola conidia
Aislamiento de punta de hifa
Es otro método de producir un cultivo puro proveniente de una sola conidia. Para ello se sigue la siguiente secuencia:
Preparar una dilución de conidias de 2500/ml con Tween 80 al 1% estéril.
Poner en un vaso de precipitación una cantidad conveniente de agar agua caliente (40oC). Este método es muy tedioso de ejecutar y tiene el inconveniente de que se contamina con facilidad Sumergir el extremo de una lámina portaobjetos en el vaso y sacarlo.
Limpiar la superficie inferior de la lámina y colocarla en una placa
Petri. La placa debe tener un papel de filtro estéril en el fondo, humedecido con agua destilada estéril. Es recomendable poner la lámina sobre una varilla de vidrio en forma de V también estéril dentro de la placa.
Sembrar el hongo con una ansa en la porción de la lámina que tiene la película del medio y estirarla cuidadosamente.
Incubar por dos - tres días.
Observar en cámara de flujo laminar al microscopio las colonias que se han formado.
Escoger la colonia que esté más aislada.
Buscar al microscopio la punta de una hifa solitaria y cortarla.
Poner la punta cortada en placa Petri conteniendo PDA o Fitoagar.
http://www.cipotato.org/library/pdfdocs/AN65216.pdf
Siembra de MO a partir del insecto muestreado
La siembra se realiza con el fin de aislar o repicar los hongos para su uso inmediato o para mantenerlos viables por un tiempo corto. La siembra o aislamiento en cultivo puro consiste en dejar crecer el hongo elegido bajo condiciones en las que pueda desarrollar y esporular convenientemente.
Para ello es necesario verter el medio de cultivo, dejarlo enfriar, acidificarlo –si fuera necesario– y colocar una pizca del hongo a sembrar. Se realiza por medio de una aguja o de un ansa, ya sea por un simple toque o por rayado continuo. Generalmente para la siembra se usan placas, tubos y frascos.
Después de la siembra se sellan las placas, tubos y frascos, se coloca la fecha y se incuba durante el tiempo conveniente hasta que se vea que el hongo ha crecido y está esporulando.
Una vez en el laboratorio, las muestras son procesadas como sigue:
1. Remojar el insecto en hipoclorito de sodio (0.5% del producto activo) durante 5 minutos.
2. Enjuagar tres a cuatro veces con agua destilada estéril.
3. Colocar papel de filtro estéril en una caja Petri esterilizada y agregar agua destilada estéril.
4. Colocar el insecto sobre el papel de filtro dentro de la caja.
5. Sellar la placa con parafilm
6. Incubar a 20 oC durante 7 días
7. Con una aguja de siembra, en la cámara de flujo laminar, tocar levemente el cuerpo del insecto donde se vea crecimiento fungoso y transferir su contenido a medio de sabouraud en una caja de Petri por estría cruzada
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